Aufenthalte am Deutschen Institut für Ernährungsforschung

Außerdem haben wir mit speziellen Pipetten das Pipettieren gelernt, indem wir verschiedene Volumina in sogenannte Reaktionsgefäße pipettierten und das Gewicht mit einer Feinwaage kontrollierten.

Am zweiten Tag hatten wir ein Meeting mit Prof. Dr. Annette Schürmann, in welchem wir einen Einblick in die Bereiche Diabetes und Epigenetik bekamen.

Am DIfE waren wir in der Abteilung Experimentelle Diabetologie tätig, in welcher die Wissenschaftler sich mit der Entstehung ernährungsbedingter Krankheiten, vor allem Adipositas und dem darauf folgenden Typ-2-Diabetes beschäftigen. Außerdem erforschen die Mitarbeiter die genetischen und epigenetischen Ursachen der Diabetesentstehung, um diese Erkenntnisse für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zu nutzen.

Zur Klärung der Ursachen werden Mäuse gezüchtet, die sich in ihrer Anfälligkeit gegenüber dem Typ-2-Diabetes unterscheiden. Durch Kreuzungsversuche dieser Mausstämme können schließlich Gene identifiziert werden, die ursächlich an der Entstehung des Diabetes beteiligt sind. Zur Charakterisierung der Funktion bestimmter Gene werden sogenannte Knockout-Mäuse generiert, die das gewünschte Gen nicht mehr aufweisen.

Zur Bestimmung des Genotyps dieser Mäuse haben wir zunächst die genomische DNA aus einer Schwanzbiopsie extrahiert. In einer anschließenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann dann der Genotyp der Mäuse bestimmt werden.

Zur Untersuchung der epigenetischen Ursachen der Diabetesentstehung wurden Mäuse des gleichen Stammes herangezogen, da diese allesamt die gleiche genetische Erbinformation besitzen. Dennoch weisen einige dieser Mäuse unter Fütterung einer fettreichen Diät einen Typ-2-Diabetes auf, wohingegen andere gesund bleiben. Zur Untersuchung der DNA-Methylierung dieser beiden Gruppen haben wir zunächst die DNA extrahiert, um anschließend eine Bisulfit-Konvertierung und eine PCR durchzuführen.

Die Bisulfit-Konvertierung ermöglicht eine Veränderung der DNA-Sequenz, bei der unmethylierte Cytosine in die Base Thymin umgewandelt werden. Die methylierten Cytosine bleiben dagegen erhalten. Um einen bestimmten Bereich der DNA (bspw. ein Gen) zu vervielfältigen, wird die mit Bisulfit konvertierte DNA für eine PCR verwendet. Zuerst wird ein Mastermix angemischt. Dieser besteht aus Reinstwasser, Puffer, Magnesiumchlorid, Taq-Polymerase (Enzym), dNTPs (einzelne Basen, die von der Polymerase bei der Strangsynthese eingebaut werden) und zwei Primern, welche den Start und das Ende des zu vervielfältigen Bereiches festlegen.

Da es zwei komplementäre DNA-Stränge gibt, unterscheidet man zwischen einem F-Primer (Forward), welcher an den Folgestrang bindet und einem R-Primer (Reverse), der den Leitstrang bindet. Im Folgenden wird der Mastermix auf die Reaktionsgefäße aufgeteilt und die bisulfitkonvertierte DNA jeder Maus einzeln zugefügt. Im PCR-Cycler findet dann die eigentliche Vervielfältigungsreaktion statt. Durch Erhitzen werden die beiden DNA Stränge voneinander getrennt (Denaturierung), dann lagern sich bei einer geringeren Temperatur (etwa 60 °C) die Primer an die DNA an (Annealing) und die Strangsynthese erfolgt bei 72 °C. Dieser Zyklus wird 45 Mal wiederholt.

Um die PCR-Produkte nachzuweisen, wird ein Agarosegel angefertigt. Das Polysaccharid Agarose wird mit dem Farbstoff Ethidiumbromid versetzt, welches sich an die Nukleinsäuren anlagert. Nach dem Kochen des Gels wird ein Kamm mit verschiedenen Taschengrößen in das Gel gesetzt. Nach dem Aushärten entsteht eine netzartige Struktur mit Poren.

Das Gel wird zunächst in die mit Pufferlösung gefüllte Gelkammer gelegt. In die erste Tasche wird ein Größenstandard aufgetragen, in dem eine Mischung verschiedener Basengrößen enthalten ist, welche bekannt sind. Die PCR-Produkte werden in die restlichen Taschen aufgetragen. Anschließend wird mit Hilfe von Elektrizität die DNA aufgetrennt. Da die DNA durch Phosphatreste am Rückgrat negativ geladen ist, wandert sie zur Kathode. Wenn das PCR-Produkt eine kleinere molekulare Größe hat, wandert es schneller durch das Gel. Um die Größe des PCR-Produkts zu bestimmen, vergleicht man deren Bande auf dem Gel mit dem Größenstandard.

Diese PCR-Produkte werden anschließend aufgereinigt und mit einem der PCR-Primer zum Sequenzieren geschickt. Bei der Sequenzierung wird die genaue Basenabfolge des PCR-Produktes bestimmt. Durch die vorhergehende Bisulfitkonvertierung der DNA kann letztendlich eine Aussage darüber getroffen werden, ob dieser Bereich eine Veränderung in der DNA-Methylierung zwischen den Gruppen aufwies.

Diese genetischen und epigenetischen Veränderungen haben oftmals Auswirkungen auf die Transkription eines bestimmten Gens. Dazu haben wir zunächst die RNA aus den Geweben der Maus isoliert und diese dann in cDNA umgeschrieben. Zur Analyse der Genexpression wird die Real-Time Polymerase-Kettenreaktion angewendet.

Des Weiteren befassten wir uns mit den Möglichkeiten zur Bestimmung des Proteingehalts einer Probe mittels der BCA-Methode sowie der Analyse der Proteinexpression durch den Western Blot. Zum Gießen der Polyacrylamidgele erfolgt der Aufbau der Vorrichtung aus Ständern, Glasplatten und Klammern. Anschließend wird ein Trenngel angemischt und in die Vorrichtung pipettiert. Die Polymerisierung dauert circa 30 Minuten. Anschließend wird ein Sammelgel pipettiert und über das Trenngel gefüllt.

Noch vor der Polymerisation wird ein Kamm mit bestimmten Taschengrößen eingesetzt. Die Anzahl der Taschen ist variabel und wird der Probenmenge und Probenanzahl angepasst. Während das Sammelgel innerhalb von 30 Minuten fest wird, werden die Proben vorbereitet. Diese werden mit Wasser und einem blauen Auftragepuffer in Reaktionsgefäße gegeben, zentrifugiert und fünf Minuten auf 95 °C erhitzt. Nachdem das Gel fertig ausgehärtet ist, werden diese in die Laufkammer gestellt. In die erste und letzte Tasche wird ein Größenstandard aufgetragen, in die restlichen Taschen werden die Proben pipettiert. Dann wird an die Kammer eine Spannung von 10 mA pro Gel gelegt. Sobald die Lauffront das Trenngel erreicht hat, wird die Spannung auf 20 mA pro Gel erhöht.

Nach einer Stunde erkennt man, dass die aufgetragenen Proben durch das Gel nach unten gelaufen sind und sich der Größe nach aufgetrennt haben. Die Glasplatten werden voneinander getrennt, das Gel gelöst und auf eine Membran gelegt. Dieser Aufbau kommt dann für eineinhalb Stunden in eine Transferkammer, wo durch das Anlegen von Strom die Proteine des Gels auf die Membran übertragen (geblottet) werden. Die Membran wird anschließend in 5% Magermilch inkubiert, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Dann wird die Membran mit einem Antikörper inkubiert, welcher gegen das zu untersuchende Protein gerichtet ist. Letztendlich wird die Membran in einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff gebundenen Antikörper inkubiert, welcher gegen den ersten Antikörper gerichtet ist. Die Auswertung erfolgt dann über ein Gerät, welches durch das Bestrahlen mit Licht einer bestimmten Wellenlänge den Fluoreszenzfarbstoff sichtbar macht und die Proteine somit als Banden sichtbar werden.

Wir hatten zudem die Möglichkeit uns im Rahmen des Rehbrücker Kolloquiums verschiedene Vorträge von Wissenschaftlern anzuhören.

Wir sind dankbar dafür, dass uns ein solches Praktikum am Deutschen Institut für Ernährungsforschung ermöglicht wurde. Wir haben viel gelernt und reichlich Einblicke in die Tätigkeiten im und außerhalb des Labors erlangen können. Ein großes Dankeschön geht an die Auricher Wissenschaftstage und deren Organisatoren.