Praktikum vom 16.10.2023 zum 27.10.2023
von Okko Determann und Hanno Lüpkes
Im Rahmen der Auricher Wissenschaftstage hatten wir, Okko Determann und Hanno Lüpkes, die einzigartige Gelegenheit, vom 16. bis zum 27. Oktober 2023, ein Praktikum am Freiburger Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik absolvieren zu dürfen. Das Max-Planck-Institut in Freiburg ist eine Forschungseinrichtung der Max-Planck-Gesellschaft, die sich mit den zwei Schlüsselbereichen der modernen Biologie befasst: Immunbiologie und Epigenetik. Immunbiologie beschäftigt sich mit dem Studium des Immunsystems, das eine komplexen Abwehrmechanismus des Körpers gegenüber Krankheitserregern, wie Bakterien, Viren und Parasiten, darstellt. Sie erforscht die Struktur, Funktion und Regulation der verschiedenen Komponenten des Immunsystems, einschließlich der Zellen und Moleküle, die an der Immunantwort beteiligt sind. Ziel der Forschung in diesem Bereich ist es, das Verständnis der Immunreaktionen zu vertiefen, um Krankheiten besser zu verstehen, vorzubeugen und zu behandeln. Der Fokus des Instituts liegt auf der Forschungsrichtung der Epigenetik, welche sich auf Veränderungen in der Genexpression bezieht, die nicht auf Abwandlungen in der DNA-Sequenz selbst zurückzuführen sind. Diese Veränderungen können durch Umweltfaktoren beeinflusst werden und haben Auswirkungen darauf, welche Gene aktiviert oder deaktiviert werden. Epigenetische Mechanismen umfassen DNA-Methylierung, Modifikation von Histonen und nicht-kodierende RNA. Die Epigenetik spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Zellentwicklung, Differenzierung und Antwort auf Umweltreize. Sie trägt auch dazu bei, das Verständnis von Krankheiten, einschließlich Krebs und neurologischen Störungen, zu vertiefen und potenzielle Ansätze für therapeutische Interventionen zu entwickeln. Im Institut sind derzeit über 300 Mitarbeiter aus 40 Nationen in 11 Forschungsgruppen tätig, die auf aktuellste wissenschaftliche Infrastruktur zurückgreifen können. Durch den multinationalen Charakter der Einrichtung findet die Kommunikation hier primär auf Englisch statt. Auch wir traten im Zeitraum überwiegend auf Englisch mit den Forscherinnen und Forschern in Kontakt. Während unseres zweiwöchigen Aufenthaltes besuchten wir das Labor der Forschungsgruppe unter der Leitung von Prof. Jenuwein, wohnten überdies aber auch einer institutsübergreifenden Vorlesung einer chinesischen Referentin bei und konnten Einblicke in die weiteren strukturellen Einblicke des Instituts erhalten.
Mit Nicholas Shukeir, dem kanadischen Labormanager, wurde uns ein erfahrener und offener Mentor zur Seite gestellt. Durch seine Anleitung und durch die Hilfe des Laborpersonals gelang es uns, durch selbst durchgeführte Experimente mit verbreiteten biologischen Verfahren, einen tiefgründigen Einblick in den Arbeitsalltag eines Laboranten zu generieren. Das Praktikum begann mit einer gründlichen Einführung, die eine Sicherheitseinweisung, die Präsentation der Forschungsziele sowie die Vorstellung der Labormitarbeiter unserer Abteilung umfasste. Unser erstes Experiment war die Durchführung eines sogenannten Western Blottings. Hierbei handelt es sich um eine Reaktion, welche den Nachweis von spezifischen zuvor aus Zellen oder Geweben extrahierten Proteinen oder Proteinkomplexen ermöglicht. Wir untersuchten in einem Vergleich die Anwesenheit unterschiedlicher Proteine in einem Wildtyp und einer genetisch veränderten Variante der Fruchtfliege (Drosophila).
In einem ersten Teilschritt führten wir eine Gelelektrophorese durch. Dabei pipettierten wir unser Probenmaterial auf ein Elektrophoresegel, an welches anschließend eine elektrische Spannung angeschlossen wurde. Je nach Größe der jeweiligen Proteine wandern diese schneller oder langsamer auf dem Gel, wodurch sie sich in unterschiedliche Bereiche auf dem Gel separieren. Nachfolgend transferierten wir die separierten Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran. Nachdem wir durch Zufügen einer Blockierlösung die Ausbildung unspezifischer Bindungen verhindern konnten, fügten wir der Membran erst einen, für das von uns betrachtete Protein Top2b, spezifisch bindenden primären Antikörper hinzu. Nach einem Waschvorgang und dem Zugeben eines sekundären Antikörpers konnten wir mithilfe eines Detektionsverfahrens die Banden der betreffenden Proteine auf der Membran sichtbar machen. Durch den Versuch, der sich über zwei Tage erstreckte, konnten wir nachweisen, dass in der genveränderten Variante das Protein Top2b nicht auftritt, wohl aber in der Ursprungsform.
Die weiteren Tage nutzten wir unter vielen anderen Experimenten für die Durchführung von PCR-Reaktionen zum Genotyping der Drosophila Fliegen. PCR werden durchgeführt, um geringe Mengen DNA zu vervielfältigen, damit genügend Material für verschiedene genetische Tests vorhanden ist. Wir führten das Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahren durch, indem wir zunächst die Ziel-DNA-Proben aus zwei verschiedenen Klonen extrahierten und isolierten. Vorab wurde an den Klonen mithilfe des CRISPR-Cas9-Verfahrens ein spezifischer DNA-Abschnitt eingefügt. Das CRISPR-Cas9-Verfahren wird angewendet, um präzise Genmodifikationen zu erzeugen, indem die Cas9-Endonuklease gezielt DNA schneidet und die natürlichen Reparaturmechanismen des Organismus nutzt, um spezifische genetische Veränderungen einzuführen.
Die Reaktionsmischung, die wir vorbereiteten, enthielt DNA-Polymerase, Nukleotide und spezifische Oligonukleotid-Primer. Die Proben wurden in einem Thermocycler zyklisch erhitzt und abgekühlt, um die Denaturierung der DNA, die Hybridisierung der Primer und die synthetische Reaktion durch die Polymerase zu ermöglichen. Durch mehrere Zyklen erhielten wir eine exponentielle Amplifikation der Ziel-DNA. Im Anschluss führten wir eine Gel-Elektrophorese durch und verglichen schließlich die Ergebnisse. Dabei betrachteten wir den Marker sowie die genotypischen Varianten Wildtyp, Klon 1 und Klon 2, um Unterschiede in den Banden festzustellen.
In der zweiten Woche besuchten wir das Fliegenlabor, in dem an Drosophila geforscht wird. Diese eignen sich besonders gut für die Forschung in der Epigenetik, da ihre kurzen Lebenszyklen, genetische Konservierung und einfache Haltung es ermöglichen, präzise Erkenntnisse über epigenetische Mechanismen zu gewinnen. Im Labor konnten wir unter Anleitung von Karolina Barucka und Mrinal Chayengia auf ein großes Portfolio von unterschiedlichsten Fruchtfliegenklonen zurückgreifen und diese hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Merkmale untersuchen und unter dem Mikroskop einer genaueren Beobachtung unterziehen. Nach etwas Übung gelang es uns beiden sogar, aus einem Haufen vieler Individuen, Exemplare nach ihrem Geschlecht und Alter zu sortieren. Mit Hilfe mikroskopischer Fotos dokumentierten wir diese Prozesse.
Abschließend führten wir die Immunfluoreszenz (IF) mit Karolina durch, um die räumliche Verteilung und Lokalisierung von Proteinen oder anderen Molekülen in den Zellen der Fruchtfliegen zu visualisieren. Zuerst sammelten wir Fruchtfliegenembryos zu einem spezifischen Zeitpunkt, etwa zwei Stunden nach der Befruchtung, mit dem Ziel C14-Embryos zu isolieren, die nach exakt 14 Zellteilungen entstanden sind. Die äußere Anordnung der Zellen beim C14-Embryo war entscheidend. Nach der Reinigung der Embryos, die mehrere Lösungen durchliefen, führten wir die Immunfluoreszenz (IF) durch.
Hierbei kam der Farbstoff DAPI zum Einsatz, der in der Fluoreszenzmikroskopie die DNA markiert und somit die Struktur unter dem Mikroskop sichtbar macht. Durch die Zugabe spezifischer Antikörper wurden die von uns untersuchten Proteine sichtbar und wir konnten ihre räumliche Verteilung unter Verwendung bestimmter Lichtwellen dokumentieren.
Die Mikroskopie und Analyse, insbesondere die Arbeit mit einem Hochauflösungs-Fluoreszenz-Mikroskop, eröffnete erstaunliche Einblicke in die Aktivität der Gene. Die Analyse von Aufnahmen wurde zu einer fesselnden Erfahrung. Insgesamt lieferte der Praktikumsalltag nicht zuletzt fachliche Einblicke in den Forschungsalltag und den hierbei eingesetzten Methoden, sondern förderte außerdem relevante Aspekte wie die Kommunikation bilingualer Natur oder Eigenverantwortung in einem fremden Umfeld. Zusammenfassend können wir die gewonnenen Eindrücke als sehr positiven Einfluss auf unsere “Soft-Skills” werten. Abschließend möchten wir uns noch einmal herzlich bei den Organisatoren der Auricher Wissenschaftstage und dem Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg für dieses lehrreiche Praktikum bedanken. Die in jederlei Hinsicht erworbenen Erfahrungen werden gewiss nachhaltigen Einfluss auf unseren Werdegang nehmen.
